刺梨( Ｒosa roxburghii Tratt) 又名茨梨，一種野生 小灌木，是西南地區常見的野生植被，成熟的刺梨果 實表面呈黃色且單寧酸含量高，含有大量的酚類化 合物，澀味重。刺梨樹是貴州省種植面積最大的野 生果樹資源，果實含有豐富的維生素 C、超氧化 物歧化酶( SOD) 、類黃酮、以及氨基酸等多種 有效物質，在營養、保健和醫藥方面具有極高的研究 利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺梨 采自貴州省龍里縣刺梨種植基地; 紅 糖 市購; DNA 抽提試劑盒( E.Z.N.ATM Mag － Bind Soil DNA Kit) 美國歐米茄公司; Qubit3.0 DNA 檢測 試劑盒 美國生命技術公司; 2 × Taq Master Mix 南 京諾唯贊生物科技有限公司; MagicPure Size Selection DNA Beads 北京全式金生物科技有限公司; 細菌通 用引物( 341F，805Ｒ) 生工生物工程( 上海) 股份有 限公司。 Pico－ 21 臺式離心機 賽默飛世爾科技公司; 其林貝爾GL-88B漩渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司; TND03－H－H 混勻型干式恒溫器 深圳拓能 達科技有限公司; DYY－6C 電泳儀電源、DYCZ－21 電 泳槽 北京市六一儀器廠; 凝膠成像系統 美國 UVP; T100TM Thermal Cyele PCＲ 儀 美國伯樂公 司; Q32866Qubit  3.0 熒光計 美國英杰生命技術 有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 刺梨發酵液制備

先將 10 L 的白色塑料桶用 75% 的酒精經表面殺菌后備用，將榨汁后( 刺梨果出 汁率約為 60% ) 的刺梨果粉碎，參照朱麗梅等方 法，將刺梨果渣、水、紅糖按質量比 3∶ 10∶ 1裝在塑料 桶中，搖勻，密封發酵，每隔 6 d 放一次氣攪拌并取 樣，連續發酵 60 d。

1.2.2 樣品總 DNA 的提取

樣品前處理: 取 2 mL 發 酵液樣品，加入到已滅菌的離心管中，在 10000 r /min 離心 3 min，棄上層液，沉淀倒置吸水 紙 上 1 min， 濾干。 樣品總 DNA 的提取: 具體提取步驟參照試劑盒 使用說明書操作，然后再利用 1% 瓊脂糖凝膠檢測 DNA 完整性，再進行下一步分析。

1.2.3 細菌

16S rDNA 基因 PCＲ 擴增 利用 DNA 檢 測試劑盒對基因組 DNA 精確定量，以確定 PCＲ 反應 需要加入的 DNA 量。PCＲ 所用的引物已經融合了 Miseq 測 序 平 臺 的 V3 － V4 通 用 引 物 ( 341F， 805Ｒ) 。 將配置好的 PCＲ 體系( 30 μL 體系) 按照下列條 件進行 PCＲ 擴增: 94 ℃預變性 3 min，94 ℃變性處理 30 s，45 ℃退火 20 s，65 ℃延伸 30 s，5 個循環; 94 ℃ 變性處理 20 s，55 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 30 s，20 個 循環，72 ℃ 延伸 5 min。PCＲ 結束后進行第二輪擴 增，引入 Illumina 橋式 PCＲ 兼容引物，配置好的 PCＲ 體系( 30 μL 體系) 按照如下反應條件進行 PCＲ 擴 增: 95 ℃預變性 3 min，94 ℃ 變性處理 20 s，55 ℃ 退 火 20 s，72 ℃ 延伸 30 s，5 個循環; 72 ℃ 延伸 5 min， 降溫到 10 ℃。擴增完成后，回收 PCＲ 產物并純化。

1.2.4 Illumina MiSeq 高通量測序

將所得到的 PCＲ 產物送往生工生物工程( 上海) 股份有限公司進行高 通量建庫和細菌多樣性分析。測序完成后進行 DNA 序列拼接和質量控制，并以此為基礎進行生物學信 息分析。

1.2.5 多樣性分析

根據 OTU 聚類分析的結果，采 用 Mothur 在 OTU 相似水平在 97% 的條件下計算多 樣性指數，包括 OTU 數量、香農指數、Chao1 指數、森 普森指數、Ace 指數和覆蓋率指數。

1.2.6 群落組成分析

利用 blastn 將 OTU 序列與相 應數據庫進行比對，觀測樣品在不同分類水平上的 群落結構，篩選出 OTU 序列的最適比對結果并在默 認滿足相似度 ＞ 90% 的基礎上，選取不同分類水平 上的細菌群落進行統計分析，根據分析結果，利用軟 件繪制所有樣本群落結構分布柱狀圖、物種可視化 圈圖等進行群落組成分析。 1.3 數據處理 數據處理采用 Ｒ 語言和 mothur( https: / /mothur. org /wiki /Chao /Ace / Shannon / Simpson /Coverage ) 軟 件 進 行 分 析，利 用 cutadapt ( https: / / pypi.org / project / cutadapt /1.2.1 /) 去 除 接 頭，PEAＲ ( https: / /cme.h －its.org /exelixis /web / software / pear /) 進 行 序 列 對 拼， Prinseq ( http: / / prinseq.sourceforge.net /) 質 量 剪 切。 測序獲得的基因序列與 Silva ( http: / /www.arb － silva.de /) 、NCBI 16S( http: / / ncbi.nlm.nih.gov /) 、ＲDP ( http: / / rdp.cme.msu.edu /misc / resources.jsp) 數 據 庫 進行比對。

2 結果與分析

Alpha 多樣性指數統計如表 2 所示，刺梨果渣在 分別發酵 6、12、18、24、30、36、42、48、54 和 60 d 時間 點上，10 個樣品的 OTU 數量和 ACE 指數在發酵 6 和 12 d 總體變化不大; ACE 指數用來估計群落中 OTU 數目的指數，ACE 指數在 12 和 18 d 值較大，表明了 12～18 d 隨著發酵的進行發酵刺梨果渣中細菌群落 豐度逐漸增大; 發酵 24 d 以后樣本中的 OTU 數量和ACE 指數開始下降; 在發酵 54 d 時 ACE 指數最大， 達 1311.29，說明發酵到第 54 d 時已達到發酵的最高 時期，發酵最后 60 d 物種多樣性開始下降。香農指 數用來反映微生物多樣性，指數越大，群落多樣性越 高，對 10 個樣本中的香農指數隨著發酵時間的變化 可知，在發酵 6 d 時香農指數較高，其次是 12 d，表明 剛開始發酵到 12 d 時，刺梨果渣中細菌群落多樣性 逐漸增高，其余發酵時間香農指數相對較穩定。森 普森指數用于估算樣品中微生物多樣性指數之一，森普森指數值越大，說明群落多樣性越低，由，發酵到 18 d 時樣本多樣性最低。發酵過程中 10 個樣本的覆蓋率均在 99% 以上，甚至在發酵 18、24、 和30 d 時覆蓋率達100% ，表明了測序的數據能夠覆 蓋目前狀態下樣品中的細菌種類，測序量已經達到 最大值，能夠真實映射樣本中的細菌群落情況，可以 用于后續的分析。Chao1 指數在發酵前 6、12 和 18 d 時值最高，一般 Chao1 指數在生態學中常用來估計 物種總數，細菌群落物種總數最高，說明該階段的細 菌群落最豐富; 后期 Chao1 指數趨于穩定，表明發酵 后期細菌群落物種趨于穩定。

3 結論

采用高通量測序技術對貴州省龍里縣刺梨 種植基地的刺梨果渣在自然發酵過程中( 0～60 d) 的 細菌群落結構及多樣性進行分析，分析共檢測出 26 個門類、40 個綱類群、74 個目類群、162 個科類群、373 個屬類群。在整個發酵過程中，主要以葡糖桿菌 屬和醋酸桿菌屬為主。雖然發酵后期葡糖桿菌屬和 醋酸菌屬大量生長繁殖，成為整個發酵過程中的優 勢菌群，使其它細菌相對豐度降低，但這些菌群在發 酵過程中一直存在，所以總體上細菌的多樣性變化 趨勢并不大，這很大程度上有可能是因為發酵過程 一直處于密封環境中，容器中的微量氧氣慢慢被消 耗，發酵后期逐漸形成厭氧環境，微好氧菌快速繁 殖，抑制其它菌群生長，使菌群中比例占優勢的好氧 菌大量減少而造成的。



 

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